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PCR实验应当注意的问题

发布时间:2011-11-04   点击次数:1514次

一、假阳性:

实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。预防措施:(1)工作区隔离。(2)改进实验操作,如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化,如后加阳性对照等。

交叉污染的处理方法: 交叉污染指扩增产物对将要扩增的样品或反应管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特别高,所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。交叉污染的处理方法包括 [1] :

1 .在 DNA 模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的 PCR 产物。一般选用波长 254nm 照射 30min ( Nature , 1990 , 34:27 )

2 . PCR 实验中使用 dUTP ,而不用 dTTP 。在扩增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase (尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的 PCR 产物,而不降解基困组 DNA 模板,然后热灭活此酶,再进行扩增反应( Gene , 1990 , 93 : 125 )。美国 PE 公司提供此类试剂盒( PCR carry-over preventionkit 。

3 .在 PCR 反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联 DNA 链,使之不能再扩增( Nucleic Acids Res , 1991 , 19 : 99 )。

二、假阴性:

如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果,提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意,许多国产 PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒 DNA ,和标本相比来说,不需纯化提取核酸的步骤,因此,如果在标本核酸纯化提取步骤有问题,即使阳性对照均呈阳性,标本检测中还可能有假阴性。

造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂,如尿素、 DMSO 、SDS 等物质,可抑制 Taq 酶活性, DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性,尤其是含有较多脓液或分泌物的标本,其中虽有待查菌,但却因标本处理不当而出现假阴性 [2] 。 设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照,若内对照未能扩增出来,说明该反应管的结果可能有问题。

三、PCR产物的鉴定

PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度,但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来, PCR 产物均应通过实验证实其特异性。在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。

综上所述, PCR 具有其优点,但也有不足之处,它是一种很好的科研手段,但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高 [9] 。目前的关键问题是如何正确应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法,但如果具备开展 PCR 需要的条件,PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前,只有针对 PCR 应用中存在的问题,采取措施,正确应用 PCR ,才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。
 

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